色谱流动相调整，你是咋调的？

来源：本站整理(lǐ) 发布时间：2020.04.17 浏览：4570 次

“小(xiǎo)王昨天的分(fēn)离度不太行呀，流动相要再调调！”这话是不是很(hěn)熟悉？调调？！咋调？如果你还不知道如何配置合适的流动相瞅这里！

秘诀1：由强到弱

一般先用(yòng)90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可(kě)以很(hěn)快地得到分(fēn)离结果，然后根据出峰情况调整有(yǒu)机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。

秘诀2：三倍规则

每减少10%的有(yǒu)机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此為(wèi)三倍规则。这是一个聪明而又(yòu)省力的办(bàn)法。调整的过程中(zhōng)，注意观察各个峰的分(fēn)离情况。

秘诀3：粗调转微调

当分(fēn)离达到一定程度，应将有(yǒu)机溶剂10%的改变量调整為(wèi)5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分(fēn)的分(fēn)离情况不再改变。

1．流动相的性质(zhì)要求一个理(lǐ)想的液相色谱流动相溶剂应具(jù)有(yǒu)低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。

选择流动相时应考虑以下几个方面：

①流动相应不改变填料的任何性质(zhì)。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有(yǒu)时遇到某些有(yǒu)机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质(zhì)。碱性流动相不能(néng)用(yòng)于硅胶柱系统。酸性流动相不能(néng)用(yòng)于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。

②纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有(yǒu)关，特别是当溶剂所含杂质(zhì)在柱上积累时。

③必须与检测器匹配。使用(yòng)UV检测器时，所用(yòng)流动相在检测波長(cháng)下应没有(yǒu)吸收，或吸收很(hěn)小(xiǎo)。当使用(yòng)示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作(zuò)流动相，以提高灵敏度。

④粘度要低（应<2cp）。高粘度溶剂会影响溶质(zhì)的扩散、传质(zhì)，降低柱效，还会使柱压降增加，使分(fēn)离时间延長(cháng)。最好选择沸点在100℃以下的流动相。

⑤对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分(fēn)离，且会使柱子恶化。

⑥样品易于回收。应选用(yòng)挥发性溶剂。

2．流动相的pH值

采用(yòng)反相色谱法分(fēn)离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分(fēn)的解离，增加组分(fēn)在固定相上的保留，并改善峰形的技(jì )术称為(wèi)反相离子抑制技(jì )术。对于弱酸，流动相的pH值越小(xiǎo)，组分(fēn)的k值越大，当pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小(xiǎo)于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分(fēn)子形式存在；对弱碱，情况相反。分(fēn)析弱酸样品时，通常在流动相中(zhōng)加入少量弱酸，常用(yòng)50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分(fēn)析弱碱样品时，通常在流动相中(zhōng)加入少量弱碱，常用(yòng)50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。

注：流动相中(zhōng)加入有(yǒu)机胺可(kě)以减弱碱性溶质(zhì)与残余硅醇基的强相互作(zuò)用(yòng)，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有(yǒu)机胺（如三乙胺）又(yòu)称為(wèi)减尾剂或除尾剂。

(三乙胺triethylamine 氨分(fēn)子中(zhōng)的氢原子被3个乙基取代的产(chǎn)物(wù)。分(fēn)子式(CH₃CH₂)₃N。易挥发的无色液體(tǐ)，有(yǒu)氨的气味。熔点－114.7℃，沸点89.3℃，相对密度0.7275（20／4℃）。溶于水和乙醇、乙醚等有(yǒu)机溶剂。三乙胺有(yǒu)碱性，与无机酸能(néng)生成易溶于水的盐类。可(kě)由N，N- 二乙基乙酰氨与氢化铝锂反应制取，也可(kě)用(yòng)乙醇胺进行气相烷基化反应合成。用(yòng)于制橡胶硫化促进剂、润湿剂和杀菌剂等，也可(kě)用(yòng)作(zuò)溶剂和用(yòng)于合成四级铵化合物(wù)。)

3. 如何选择缓冲液PH值在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分(fēn)析物(wù)的Pka，高于或低于Pka两个PH值单位的，有(yǒu)助于获得好的、尖锐的峰，从HH公(gōng)式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液PH值高于或低于Pka两个单位，化合物(wù)中(zhōng)99％以一种形式存在，而一种形式存在的化合物(wù)才能(néng)获得好的尖锐的峰。显示的是它的离子形式和中(zhōng)性化合物(wù)的转变，苯甲酸的Pka等于4.2，理(lǐ)论上由HH公(gōng)示得知，当溶液PH值等于2.2时，99％的苯甲酸以中(zhōng)性化合物(wù)存在，PH值等于6.2时99%的苯甲酸以离子形式存在，所以当缓冲液PH值等于2.2时，中(zhōng)性化合物(wù)以羧酸形式保留于反相柱，表1列出了一般缓冲液和他(tā)们的缓冲范围。从表1知磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液能(néng)用(yòng)于PH值等于2.2。

当化合物(wù)只有(yǒu)氨基时，缓冲體(tǐ)系的选择十分(fēn)简单，大多(duō)数氨基化合物(wù)在PH值小(xiǎo)于9时都被质(zhì)子化，所以所有(yǒu)PH值在7或更低的溶液均适合应用(yòng)，你也许会问水的PH值大约是7，為(wèi)什么还用(yòng)缓冲盐，因為(wèi)缓冲盐有(yǒu)助于增加方法的可(kě)靠性，以及色谱峰的尖锐性，PH值的降低有(yǒu)助于氨基化合物(wù)保留的减弱，减小(xiǎo)化合物(wù)与硅胶表面硅羟基的作(zuò)用(yòng)，而使峰更尖锐，从表1 可(kě)值，任何缓冲液均可(kě)应用(yòng)于氨基化合物(wù)的分(fēn)析，但我们认為(wèi)PH值等于3的磷酸钾盐最适合用(yòng)于氨基化合物(wù)的分(fēn)析。

在上面两个例子中(zhōng)，PH＝3的磷酸钾盐都能(néng)获得良好的应用(yòng)，在一般情况下，它是含羧基和氨基化合物(wù)分(fēn)析中(zhōng)最好的缓冲液，并且我们认為(wèi)在氨基化合物(wù)分(fēn)析中(zhōng)钾盐比钠盐更好。

4．流动相的脱气

HPLC所用(yòng)流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工(gōng)作(zuò)。气泡还会影响柱的分(fēn)离效率，影响检测器的灵敏度、基線(xiàn)稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基線(xiàn)不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中(zhōng)的氧还可(kě)能(néng)与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气體(tǐ)还会引起溶剂pH的变化，对分(fēn)离或分(fēn)析结果带来误差。溶解氧能(néng)与某些溶剂（如甲醇、四氢呋喃）形成有(yǒu)紫外吸收的络合物(wù)，此络合物(wù)会提高背景吸收（特别是在260nm以下），并导致检测灵敏度的轻微降低，但更重要的是，会在梯度淋洗时造成基線(xiàn)漂移或形成鬼峰（假峰）。在荧光检测中(zhōng)，溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可(kě)降低达95%。在電(diàn)化學(xué)检测中(zhōng)（特别是还原電(diàn)化學(xué)法），氧的影响更大。

除去流动相中(zhōng)的溶解氧将大大提高UV检测器的性能(néng)，也将改善在一些荧光检测应用(yòng)中(zhōng)的灵敏度。常用(yòng)的脱气方法有(yǒu)：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。

对混合溶剂，若采用(yòng)抽气或煮沸法，则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。

超声脱气比较好，10~20分(fēn)钟的超声处理(lǐ)对许多(duō)有(yǒu)机溶剂或有(yǒu)机溶剂/水混合液的脱气是足够了（一般500ml溶液需超声20~30min方可(kě)），此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多(duō)。

离線(xiàn)（系统外）脱气法不能(néng)维持溶剂的脱气状态，在你停止脱气后，气體(tǐ)立即开始回到溶剂中(zhōng)。在1~4小(xiǎo)时内，溶剂又(yòu)将被环境气體(tǐ)所饱和。

在線(xiàn)（系统内）脱气法无此缺点。最常用(yòng)的在線(xiàn)脱气法為(wèi)鼓泡，即在色谱操作(zuò)前和进行时，将惰性气體(tǐ)喷入溶剂中(zhōng)。严格来说，此方法不能(néng)将溶剂脱气，它只是用(yòng)一种低溶解度的惰性气體(tǐ)（通常是氦）将空气替换出来。此外还有(yǒu)在線(xiàn)脱气机。

一般说来有(yǒu)机溶剂中(zhōng)的气體(tǐ)易脱除，而水溶液中(zhōng)的气體(tǐ)较顽固。在溶液中(zhōng)吹氦是相当有(yǒu)效的脱气方法，这种连续脱气法在電(diàn)化學(xué)检测时经常使用(yòng)。但氦气昂贵，难于普及。

5．流动相的滤过所有(yǒu)溶剂使用(yòng)前都必须经0.45µm（或0.22µm）滤过，以除去杂质(zhì)微粒，色谱纯试剂也不例外（除非在标签上标明“已滤过”）。用(yòng)滤膜过滤时，特别要注意分(fēn)清有(yǒu)机相（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜。有(yǒu)机相滤膜一般用(yòng)于过滤有(yǒu)机溶剂，过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜只能(néng)用(yòng)于过滤水溶液，严禁用(yòng)于有(yǒu)机溶剂，否则滤膜会被溶解！溶有(yǒu)滤膜的溶剂不得用(yòng)于HPLC。对于混合流动相，可(kě)在混合前分(fēn)别滤过，如需混合后滤过，首选有(yǒu)机相滤膜。现在已有(yǒu)混合型滤膜出售。6．流动相的贮存流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能(néng)贮存在塑料容器中(zhōng)。因许多(duō)有(yǒu)机溶剂如甲醇、乙酸等可(kě)浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。这种被污染的溶剂如用(yòng)于HPLC系统，可(kě)能(néng)造成柱效降低。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。

磷酸盐、乙酸盐缓冲液很(hěn)易長(cháng)霉，应尽量新(xīn)鲜配制使用(yòng)，不要贮存。如确需贮存，可(kě)在冰箱内冷藏，并在3天内使用(yòng)，用(yòng)前应重新(xīn)滤过。容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质(zhì)沉淀和可(kě)能(néng)生長(cháng)的微生物(wù)。因甲醇有(yǒu)防腐作(zuò)用(yòng)，所以盛甲醇的瓶子无此现象。

7．卤代有(yǒu)机溶剂应特别注意的问题卤代溶剂可(kě)能(néng)含有(yǒu)微量的酸性杂质(zhì)，能(néng)与HPLC系统中(zhōng)的不锈钢反应。卤代溶剂与水的混合物(wù)比较容易分(fēn)解，不能(néng)存放太久。卤代溶剂（如CCl₄、CHCl₃等）与各种醚类（如乙醚、二异丙醚、四氢呋喃等）混合后，可(kě)能(néng)会反应生成一些对不锈钢有(yǒu)较大腐蚀性的产(chǎn)物(wù)，这种混合流动相应尽量不采用(yòng)，或新(xīn)鲜配制。此外，卤代溶剂（如CH₂Cl₂）与一些反应性有(yǒu)机溶剂（如乙腈）混合静置时，还会产(chǎn)生结晶。总之，卤代溶剂最好新(xīn)鲜配制使用(yòng)。如果是和干燥的饱和烷烃混合，则不会产(chǎn)生类似问题。

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